Doctorant en Biochimie des protéines membranaires H/F

Sujet de thèse :
Décryptage de l'action moléculaire de TMEM70 dans la biogenèse de la F1Fo ATP synthase et impact de ses mutations.
Les mitochondries sont avant tout connues pour leur rôle dans la synthèse d’ATP. L’enzyme responsable est la F1Fo-ATP synthase, un complexe protéique multi-sous-unités présent dans la membrane mitochondriale interne. Celui-ci forme un nano-moteur rotatif qui couple la translocation de protons au travers de la membrane mitochondriale interne à la génération d’ATP à partir d’ADP et de Pi dans la matrice. L’assemblage de cet édifice est un processus très complexe et relativement peu compris. TMEM70 est l’un des facteurs d’assemblage de l’ATP synthase récemment identifié. Des mutations de TMEM70 sont associées à des encéphalo-cardiomyopathies mitochondriales néonatales causée par une très forte diminution de quantité d’ATP synthase.
Nous avons construit et utilisé différents modèles cellulaires (interférence d’ARN, CRISPR/Cas9, fibroblastes de patients) qui nous ont permis de découvrir la cible de TMEM70 qui n’est autre que la sous-unité centrale de la turbine membranaire de l’ATP synthase, la sous-unité c formée de 2 hélices transmembranaires liées par une boucle dans la matrice. La sous-unité c est synthétisée dans le cytosol puis importée dans la mitochondrie. Une séquence d’évènements peu comprise où intervient TMEM70 mène à son insertion dans la membrane interne de manière à ce que ses deux extrémités se retrouvent du côté inter-membranaire, et à l’assemblage de huit copies en un anneau qui sera ensuite inséré dans l’ATP synthase en formation.
Afin de mieux comprendre cette séquence d’évènements et l’implication de TMEM70, ainsi que les mécanismes pathogènes de ses mutations, le projet vise à utiliser des expériences in vitro et in organello permettant d’étudier l’insertion et l’assemblage des anneaux de sous-unités c avec TMEM70 et d’autres partenaires récemment identifiés. Le projet fera appel à la production in vitro de protéines et reconstitution en nanodisques ainsi qu’à l’import in organello de précurseurs protéiques dans des mitochondries isolées, approches pour lesquelles nous avons déjà fait la preuve de concept.
Ces études permettront à la fois de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliquant TMEM70 mais aussi de mieux appréhender le mécanisme pathogène des encéphalo-cardiomyopathies mitochondriales associées aux mutations de TMEM70.

Nous nous baserons sur de nouveaux outils d’étude in vitro récemment développés et déjà validés au laboratoire (production de protéines in vitro ; reconstitution en nanodiscs ; import in organello de précurseurs marqués ; purification de protéines NiNTA et FLAG ; analyses biochimiques de protéines par électrophorèse : SDS-PAGE, BN-PAGE, 2D, western blot), ainsi que sur les nombreux outils disponibles au laboratoire (lignées cellulaires, anticorps, constructions), et sur notre expertise dans l’étude des mitochondri
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